Günümüzde PCR uygulamaları, başta moleküler biyoloji laboratuvarları olmak üzere pek çok çeşitli laboratuvarın olmazsa olmaz bir parçası haline gelmiştir. Bilim dünyasına son derece önemli katkılarda bulunan bu teknik, şu anda içinde bulunduğumuz ve SARS-CoV-2 virüsünün sebep olduğu pandeminin de etkisiyle popülaritesini bir hayli artırmıştır. PCR teknolojisinin COVID-19 teşhisinde nasıl kullanıldığına geçmeden önce, teşhis sırasında kullanılan yöntemlerin daha iyi özümsenmesi amacıyla PCR tekniğinin temel prensipleri, yaygın çeşitleri ve genel işleyişi hakkında kısa bilgiler vereceğim.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve Geleneksel PCR Yöntemi
Polimeraz zincir reaksiyonu, DNA içerisindeki istenilen herhangi bir parçanın enzimatik olarak çoğaltılması işlemidir. Bu parça, belli bir gen veya üzerinde çalışılmak istenilen bir sekans olabilir ve çoğaltma işleminin sonucunda hedef parçanın milyarlarca kopyası elde edilir. Geleneksel PCR yöntemindeki temel prensipleri iyi anlamak, farklı PCR metotlarının anlaşılmasını kolaylaştırmak adına bir hayli önemlidir. Polimeraz zincir reaksiyonu, birbirini takip ve tekrar eden döngülerden meydana gelir. Bu döngülerin her biri birbirinin aynısıdır ve üç ana aşamadan oluşur: Denatürasyon, bağlanma ve uzama. Denatürasyon aşamasında sıcaklık yaklaşık 93°C- 95°C civarına getirilir ve DNA zincirlerinin arasındaki hidrojen bağlarının koparılarak çift zincirli yapının bozulması amaçlanır. DNA’nın çift zincirli yapısının bozulmasının ardından sıcaklık 50°C-65°C civarına düşürülür ve her bir zincire daha önceden ortama eklenmiş ve özel olarak hazırlanmış primerler bağlanır. Primerler, hedef DNA dizilerinin belli bölümlerini içeren ve bağlanma aşamasında tek zincirli DNA’ya komplementer olduğu yerden tutunan oligonükleotitlerdir. Primerlerin üretimi oldukça meşakkatli bir süreç gerektirdiğinden dolayı belli üreticiler tarafından hazır olarak satın alınabilirler. PCR uygulamalarında ileri ve geri primer olmak üzere iki çeşit primer bulunur ve bu primerler yaklaşık 15-25 baz çifti uzunluğunda olurlar. Primerler, denatüre olmuş tek zincirli DNA’ların bir tanesine ileri primer bir tanesine de geri primer bağlanacak şekilde tutunurlar ve daha sonra hedef DNA dizisinin iki farklı uçtan sentezlenmesinde rehber görevi görürler.
Primerlerin bağlanmasının ardından az önce de bahsedildiği gibi uzama aşaması başlar ve bunun için sıcaklık 72°C civarına çıkartılır. Uzama aşamasında, ortama daha önceden eklenmiş olan ve DNA’nın yapı taşlarını oluşturan dNTP’ler (deoksiribonükleotit trifosfat) ile yüksek sıcaklıklarda işlevini sürdürebilmesi sebebiyle thermus aquaticus bakterisinden izole edilen Taq polimeraz enzimi kullanılır. Bu enzim ve ortamdaki dNTP’ler eşliğinde sentezlenmeye başlayan komplementer zincir, primerlerin bağlandığı bölgede 5′ uçtan 3′ uca doğru uzar ve bu şekilde bir tam döngü tamamlanmış olur. Ancak tamamlanmış olan bu ilk döngüde primer bağlanması ve uzamasıyla oluşan zincirlerin herhangi bir durma noktası olmaksızın 5′ uçtan 3′ uca doğru sentezlenmesi sebebiyle hedef DNA dizisi spesifik olarak elde edilemez. Bunun üzerine 2. döngüde gerçekleşen bağlanma ve uzama aşamasında, bir önceki döngüde ileri primer tarafından oluşturulmuş olan zincire geri primer, bir önceki döngüde geri primer tarafından oluşturulmuş olan zincire ise ileri primer bağlanır ve yeni zincirler sentezlenir. Bu sayede bir sonraki yani 3. döngünün denatürasyon aşamasında istenilen hedef DNA dizisi, ilk defa doğru uzunlukta spesifik olarak elde edilmiş olur. Bu süreden sonra meydana gelen her döngüde hedef DNA dizisinin sayısı ikiye katlanarak üstel olarak artmaya devam eder. Toplamda n tane döngüden oluşan bir PCR işleminde hedef DNA dizisi sayısı teorik olarak 2n-2n olacaktır ki bu da 30 döngüden oluşan bir işlem sonunda yaklaşık 1.073.741.764 hedef DNA dizisi elde edileceğini göstermektedir.
Her bir döngü içindeki denatürasyon ve bağlanma aşamaları yaklaşık otuzar saniye ve uzama aşaması da yaklaşık iki dakikayı bulabilirken aşamaların sıcaklıkları ve süreleri yapılacak analizin çeşidine veya incelenmek istenen örneğe göre değişiklik gösterebilir. Bununla birlikte 30-35 döngülük bir PCR işleminin tamamlanması yaklaşık 2 saat sürebilmektedir. Deney sırasında PCR tüpleri içerisinde ilgili DNA örneği, primerler ve dNTP’ler olması gerektiği gibi uygun tampon çözeltileri ve doğru iyonu konsantrasyonu da bulunmalıdır aksi takdirde yeterince başarılı bir amplifikasyon gerçekleştirilemeyebilir. Özetle geleneksel PCR yönteminde, örnekler sadece belli bir ısıl döngüleme işlemine tabi tutulur ve sonuçların görüntülenebilmesi için elde edilmiş olan DNA dizileri PCR işleminin bitmesiyle beraber jel elektrofezinde yürütülerek amplifikasyonun gerçekleşip gerçekleşmediği analiz edilir. Tüm bu işlemlerin sonucunda, incelediğimiz hedef DNA dizilerinin sadece varlığı veya yokluğuyla ilgili verilere ulaşılırken başlangıçtaki miktarı hakkında fikir edinilemez.
Real-Time Quantative PCR (qPCR)
Gerçek zamanlı PCR (qPCR), geleneksel PCR uygulamalarıyla her ne kadar benzer süreçler içerse de geleneksel PCR tekniğinin yetersiz ve kısıtlı kaldığı pek çok alanda öne çıkmayı başarmış, oldukça güçlü bir tekniktir. Bu teknikte geleneksel PCR tekniğinin aksine, sonuçların görülmesi için işlem sonunda jel elektrofezine ihtiyaç duyulmaz, amplifikasyon verileri kesin ve eş zamanlı olarak kantitatif bir şekilde gözlenir. Bu sayede işlem tek bir tüpte başlamış ve bitmiş olur, bu da aynı zamanda kontaminasyon riskini azaltır. Gerçek zamanlı PCR, oldukça hassas gen ekspresyonu analizleri ve patojen tespitlerinde etkili bir şekilde kullanılmaktadır. Ayrıca bu tekniğin en güçlü yönlerinden biri de eş zamanlı amplifikasyon ölçümü yapabilmesi sayesinde işlem başlangıcındaki DNA örneği miktarının net bir şekilde tayin edilebilmesidir. Sağladığı pek çok avantajla birlikte değerlendirildiğinde qPCR, son derece önemli ve vazgeçilmez bir tekniktir.
Gerçek zamanlı PCR işleminde amplifikasyonun eş zamanlı olarak tespit edilmesi için kullanılan iki ana yöntem vardır: Boya temelli spesifik olmayan tespit ve prob temelli spesifik tespit. İki yöntemde de temel ilke amplifikasyonla birlikte artan floresans miktarının eş zamanlı olarak ölçülmesine dayanır ve her iki yöntemle de yapılan çalışmalarda başlangıç DNA konsantrasyonu hesaplanabilir. Boya temelli spesifik olmayan tespitlerde kullanılan boyalar ortamdaki çift zincirli DNA’lara bağlanırlar ve bağlanmamış hallerine kıyasla çok daha güçlü ışıma yaparlar. Bu boyalar, hedef DNA dizilerine spesifik olmadıkları için bağlanacakları DNA’ları seçmezler ve ortamdaki bütün çift zincirli DNA’lara bağlanırlar. Bu sebeple boya temelli yöntemlerle elde edilen amplifikasyon miktarının duyarlılığı prob temelli yöntemler kadar yüksek değildir ve boya temelli tespit yöntemleri aynı deneyde birden fazla farklı örneğin çalışılmasına olanak sağlamazlar. Öte yandan diğer qPCR tespit yöntemlerine kıyasla en ekonomik ve kullanışlı olan yöntem boya temelli tespit yöntemidir.
Bir diğer tespit yöntemi olan prob temelli spesifik tespit yönteminde ise hazırlanan problar çoğaltılması istenilen hedef DNA dizilerine özel olarak hazırlanır. Bu sayede, hazırlanan problar ortamdaki tüm çift zincirli DNA’lara değil sadece amplifikasyona uğrayan hedef DNA dizilerine bağlanarak işleme özgüllük kazandırır. Problar, hedef DNA dizilerine komplementer olarak hazırlanan ve bir ucunda floresans molekülü bir ucunda da söndürücü molekül bulunduran oligonükleotitlerdir. Prob temelli spesifik tespitlerin esas mantığı genel olarak birbirine benzese de yapılacak tahlillerin türüne veya ilgili örneğin karakterine göre çeşitli şekillerde problar kullanılabilir. Genel olarak düz problar ve şekilli problar olmak üzere ikiye ayrılırlar ve her birinde floresans molekülünün aktive edilmesinde farklı yollar izlenir. Bunlar içerisinden düz problar kategorisinde yer alan ve popülaritesi en yüksek olan hidroliz problarının işleyişini kısaca anlatmak gerekirse; söndürücü molekül, floresans molekülüyle aynı probda olduğu ve hedef DNA dizisinin amplifikasyonu gerçekleşmediği sürece floresansın ışıma yapmasına izin vermez. Ancak probun hedef DNA dizilerine bağlanması halinde, uzama aşamasında primerlerin yardımıyla başlayan 5’ uçtan 3’ uca doğru ilerleyen DNA sentezi sebebiyle prob parçalanır ve floresans molekülle söndürücü molekül birbirinden ayrılmış olur. Floresans molekül söndürücü molekülden ayrıldıktan sonra ışıma yapmaya başlar ve bu ışımalar hedef DNA dizisinin amplifikasyonunu kantitatif olarak kesin bir şekilde tayin eder.
Daha önce de bahsedildiği gibi prob temelli tespitler hedef DNA dizilerine özel olarak çalışırlar ve boya temelli tespit yöntemine kıyasla daha isabetli sonuç verirler. Üstelik hedef DNA dizilerine olan özgüllükleri sayesinde tek bir deneyde birden fazla örneğin aynı anda çalışılmasına olanak sağlarlar fakat temin edilebilmeleri oldukça maliyetlidir. Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın gerçek zamanlı PCR tekniğinin en güçlü yönü, sürecin başından sonuna kadar olan zaman dilimi kapsamında amplifikasyon miktarı grafiğinin elde edilmesidir. İşlem sonunda elde edilen grafik incelendiğinde başlangıç fazı, üstel faz ve plato fazı olmak üzere kabaca üç faz gözlenebilir.
Amplifikasyon gerçekleşmesi beklenen pozitif bir örnek üstünden konuşursak; başlangıç fazı, hedef DNA dizisinin amplifikasyonunun belirlenebilmesi için yeterli sinyal alınamadığı ve aktif floresans ışımalarla aktif olmayanların net bir şekilde ayırt edilemediği süreçtir. Üstel faz, hedef DNA dizilerinden gelen ışımaların sağlıklı bir şekilde değerlendirilebildiği ve amplifikasyon miktarının hızla arttığı evredir. Üstel fazın erken aşamalarında, hedef DNA amplifikasyonundan gelen ışımaların arka plandaki ışımalardan sıyrılarak ayırt edilebildiği noktaya eşik değeri (threshold), bu değere ulaşıldığı andaki döngü sayısına ise eşik döngüsü (Ct) denir. Ct değeri çoğu gerçek zamanlı PCR makinelerinde belli yazılımlar sayesinde otomatik olarak ayarlanır ve bu değer, başlangıçtaki DNA miktarının, dolayısıyla da viral bir örnek incelendiğinde başlangıçtaki virüs yükünün bulunmasını sağlar.
Örneğin, eşik değerine 20. döngüde ve 25. döngüde ulaşan yani Ct değerleri 20 ve 25 olan iki farklı örneğin başlangıçtaki DNA miktarını kendi aralarında basit bir şekilde kıyaslamak için hangi örneğin Ct değerinin daha düşük olduğuna bakmamız yeterli olur ve Ct değeri 20 olan örneğin başlangıç DNA miktarının daha fazla olduğu yorumu yapılabilir. Başlangıç DNA miktarı fazla olan örnek, eşik değerine daha çabuk ulaşır ve daha düşük Ct değerine sahip olur yani yarışa önde başladığı için eşik değerini daha önce geçer. Bu değerler, qPCR makinelerinin yazılımları sayesinde deney sonunda kesin olarak tayin edilebilirler. Son olarak da ortamdaki primerler, dNTP’ler ve diğer bileşenlerin tükenmeye başlamasıyla birlikte amplifikasyon azalarak biter ve bu faza da plato fazı denir. Tüm fazlar içerisinde en sağlıklı ve kesin sonucu almak için daima üstel fazdaki veriler incelenir ve yorumlanır.
Reverse Transcription Real-Time Quantative PCR (RT-qPCR) ve COVID-19 Teşhisi
Virüsler, canlı olmayan, fakat canlı hücreleri enfekte ederek çoğalabilen varlıklardır. Virüsler temel olarak bir protein kılıf içerisine paketlenmiş genetik materyaller taşırlar ve genomları ya tamamen DNA’dan ya da tamamen RNA’dan oluşur. COVID-19’a sebep olan SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2) adlı virüs, RNA genomu taşıdığından dolayı PCR işlemlerinde kullanılmadan önce örneğe ters transkripsiyon uygulanması gerekir. Ters transkripsiyon, ters transkriptaz enzimi kullanılarak RNA’dan cDNA sentezlenmesi işlemidir. Elde edilen cDNA tek zincirlidir ve sonrasında Taq polimeraz enzimi eşliğinde çift zincirli DNA’ya çevrilir. Bu şekilde, PCR uygulamaları ile gen ekspresyonu seviyelerinin veya RNA genomu taşıyan patojenlerin tespitinin yapılması sağlanır. RT-qPCR deneylerinde işlem iki farklı şekilde gerçekleşebilir: Tek basamakta veya iki basamakta. İki basamakta gerçekleşen işlemin ilk basamağında örnekten alınan RNA’lardan ters transkriptaz enzimi ile cDNA’lar sentezlenir ve sentezlenen cDNA’lar Taq polimeraz enzimiyle çift zincirli DNA’ya çevrilmek ve daha sonra çoğaltılmak üzere ikinci basamağa yani ikinci tüpe aktarılırlar. Tek basamakta gerçekleşen işlemde ise ters transkripsiyon ile cDNA’dan çift zincirli DNA eldesi ve çoğaltılması tek bir tüpte gerçekleşir. Her iki yöntemle de uygulanan deneylerin farklı avantaj ve dezavantajları mevcuttur.
Tek basamaklı RT-qPCR deneylerinde gene özgü primerler kullanılır ve bu primerler aracılığıyla cDNA ve sonrasında gelen amplifikasyon aynı tüpte gerçekleşir ve tamamlanır. Tüm deneyin tek tüpte başlayıp bitmesi sayesinde pipetleme işlemleri en aza indirilerek kontaminasyon riski azaltılır. Tek basamaklı deneyler, yüksek verimli tarama teknolojileriyle oldukça uyumlu bir şekilde çalışır ve iki basamaklı deneylere göre daha hızlı bir şekilde sonuçlanır. Ancak RT (ters transkripsiyon) ve qPCR kısımları ayrı ayrı optimize edilemez ve örnekten gelen cDNA ileride tekrar kullanılmak üzere stoklanamaz.
İki basamaklı RT-qPCR deneylerinin ters transkripsiyon aşamasında ise; gene özgü primerler, mRNA’nın poly-A kuyruğuna bağlanmak üzere üretilen oligo(dT) primerler, RNA’nın herhangi bir bölgesine bağlanıp çeşitli cDNA parçaları sentezlenmesini sağlayan rastgele primerler veya bu primerlerin (oligo(dT) primerler, rastgele primerler ve gene özgü primerler) beraber bulunduğu primer karışımları gibi çeşitli stratejiler kullanılabilir. İki basamaklı RT-qPCR deneylerinin ilk basamağı ve ikinci basamağının ayrı tüplerde gerçekleşmesi nedeniyle RT ve qPCR kısımlarının ayrı bir şekilde optimizasyonu yapılabilir, ileride çeşitli amaçlarla tekrar kullanılmak üzere cDNA’lar stoklanabilir ve hassasiyeti yüksektir. Fakat fazladan pipetleme işlemleri gerektirmesi sebebiyle kontaminasyon riski daha fazladır ve tek basamaklı deneylere kıyasla daha çok zaman almaktadır.
Daha önce COVID-19’a sebep olan SARS-CoV-2 virüsünün RNA genomu taşıdığından söz etmiştik. SARS-CoV-2 genomu yaklaşık 30.000 nükleotitten oluşur ve bu genomun farklı bölgelerinden yapısal ve yapısal olmayan çeşitli proteinler kodlanır. SARS-CoV-2 genomundan kodlanan 4 ana yapısal protein vardır: ORF2 geninin kodladığı S proteini (spike surface glycoprotein), ORF4 geninin kodladığı E proteini (envelope protein), ORF5 geninin kodladığı M proteini (membrane glycoprotein) ve ORF9 geninin kodladığı N proteini (nucleocapsid phophoprotein). COVID-19 teşhisinde kullanılan RT-qPCR uygulamaları için belli bölgelere özel olarak hazırlanan primerler ve problar, genel olarak az önce bahsettiğimiz çeşitli yapısal proteinlerin baz dizilimlerini veya toplamda 16 farklı yapısal olmayan proteinden oluşan ORF1ab poliproteinini kodlayan ve tüm genomun yaklaşık üçte ikisini oluşturan ORF1ab geninin baz dizilimlerini hedef alarak hazırlanabilirler.
COVID-19 Testlerindeki Hatalı Negatif ve Hatalı Pozitif Sonuçlar
Gerçek zamanlı PCR her ne kadar hassas bir teknik olsa da zaman zaman yapılan testlerde hatalı sonuçlarla karşılabilmektedir. Hatalı negatif sonuçlar, hastadan alınan sürüntü örneğinin yanlış veya eksik bir şekilde alınması, sürüntü örneğinin hastalığın uygun bir döneminde alınmaması ya da alınan örneklerin ilgili birimlere nakil süreci ile sonrasındaki muhafaza işlemleri aşamasında oluşabilecek herhangi bir uygunsuzluk sebebiyle meydana gelebilir. Hastalığın erken döneminde sürüntü alınan enfekte kişilerde hatalı negatif sonuç görülme oranının, hastalığın ağır seyretmeye başladığı dönemde sürüntü alınan enfekte kişilerdeki hatalı negatif sonuç görülme oranından daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Öte yandan hatalı pozitif sonuçlar, aynı anda teste tabi tutulan farklı bir enfekte örnekle meydana gelen çapraz kontaminasyon veya spesifik olmayan primer kullanımı sebebiyle ortamdaki başka virüslerle çapraz reaksiyon gerçekleşmesi sebebiyle gözlenebilir. Büyük ölçüde laboratuvar kontaminasyonu sebebiyle gerçekleşmesinden dolayı hatalı pozitif sonuçların görülme olasılığı hatalı negatif sonuçların görülme olasılığından daha düşüktür. Sonuç olarak doğru prosedür, ugyun teknik seçimi ve deneyimli personel eşliğinde yapılan RT-qPCR testleri son derece spesifik ve güvenilirdir.
Yazar; Ege Bahçelioğlu
Referanslar:
Bustin S. (2010). Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50(4). 217-226
Jungreis I., Sealfon R., Kellis M. (2021). SARS-CoV-2 gene content and COVID-19 mutation impact by comparing 44 Sarbecovirus genomes. Nature Communications. 12(1). 2642.
Kanji J., Zelyas N., Mcdonald C., Pabbaraju K., Hu J. (2021). False negative rate of COVID-19 PCR testing: a discordant testing analysis. Virology Journal. 18(13).
Linda J. Carter, Linda V. Garner, Jeffrey W. Smoot, Yingzhu Li, Qiongqiong Zhou, Catherine J. Saveson,(2020). Assay Techniques and Test Development for COVID-19 Diagnosis. ACS Central Science 6 (5), 591-605. DOI: 10.1021/acscentsci.0c00501
Nagy A., Vitaskova E., Cernikova L. (2017). Evaluation of TaqMan qPCR System Integrating Two Identically Labelled Hydrolysis Probes in Single Assay. Scientific Reports. 7(41392).
Naqvi A., Fatima K., Mohammad T. (2020). Insights into SARS-CoV-2 genome, structure, evolution, pathogenesis and therapies: Structural genomics approach. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.1866(10). 165878.
Tahamtan A., Ardebili A. (2020). Real-time RT-PCR in COVID-19 detection: issues affecting the results, Expert Review of Molecular Diagnostics, 20(5), 453-454, DOI: 10.1080/14737159.2020.1757437
Wong L., Medrano J. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39(1). 75-85
Yelin I., Aharony N., Tamar E., Argoetti A., Berenbaum D. (2020). Evaluation of COVID-19 RT-qPCR Test in Multi sample Pools. Clinical Infectious Diseases 71(16). 2073-207
Yoshimoto F. (2020). The Proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS CoV-2 or n-COV19), the Cause of COVID-19. Protein J. 39(3). 198-216
Blog Auraxis 